鸡鸭鹅病防治网联合驰骋祥兽医研究所共同分享：

摘要：

  浙江省两个鸭养殖场中疑似鸭坦布苏病毒（duck Tembusu virus,DTMUV）感染的雌麻鸭卵巢病料，经组织研磨处理，DF-1细胞纯化，RT-PCR特异性扩增，成功分离了两株DTMUV，分别命名为ZJ201501和ZJ201504。利用全长分段RT-PCR扩增、序列测定、序列拼接方法成功得到2株病毒的全基因序列，并进行了系统进化树的分析。

  自2010年4月鸭坦布苏病毒病首次在中国爆发以来，该病就迅速传播至浙江省、福建省、江苏省、山东省、江西省、广东省、广西省、安徽省、河南省、河北省、北京市等地，且近几年均有感染DTMUV的报道。鸭坦布苏病毒病作为一种急性传染病能够引起肉鸭生长缓慢，产蛋鸭产蛋下降，共济失调和瘫痪等临床症状，发病率高达100%，死亡率达5%--15%，给我国鸭养殖业造成了严重的危害。DTMUV能够感染多种宿主如鸭、鸡、鹅、鹦鹉、蚊子、小鼠等，属于单股正链RNA病毒，其核酸容易发生变异，从而导致编码的关键氨基酸变异，最终影响病毒的抗原性等改变。因此，对DTMUV进行流行病学调查、分离鉴定、序列分析等研究可以使我们及时掌握病毒的遗传进化信息，为有效、快速的对病毒的监测、防控提供理论基础，保护鸭养殖业的健康发展。

1、样品采集及处理

  样品来源于浙江省宁波市和余姚市某2个发生产蛋鸭产蛋下降的养鸭场，发病后d3，分别无菌剖杀3只发病鸭并采集脾脏和卵巢组织，低温下送到实验室，加入含10×双抗的无菌PBS（1mL/g）后，置于高通量组织研磨器中研磨，将研磨液经4℃、12 000×g离心15 min后，取上清液体经直径0.22 μm滤器过滤后，分装置于-80℃保存备用。

2、病毒分离及鉴定

  将长有80%单层DF-1细胞的T25细胞培养瓶用无菌PBS漂洗2次，加入900μL DMEM培养基和100 μL样品，混匀后置于含5% CO₂、 37℃细胞培养箱感作2 h，每隔半小时晃动1次以使病毒感作均匀。2 h后弃去混合液，并用无菌PBS漂洗2次，最后加入5 mL含2%FBS的DMEM培养液，每隔12 h观察细胞是否出现病变。结果显示，病料接种DF-1细胞48 h后，细胞开始出现变圆、皱缩、聚堆等眼观病变，部分细胞脱落。60 h后，60%的细胞发生病变，收取出现病变的细胞上清进行RNA抽提、反转录得到cDNA，以cDNA为模板，利用DTMUV特异性鉴定引物进行PCR扩增，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，2和3泳道出现300 bp大小的特异条带，表明为病料中含有DTUMV，分别命名为ZJ201501和ZJ201504。

3、全基因组分段扩增

  以鉴定为DTMUV阳性的样品ZJ201501和ZJ201504 cDNA为模板，9对两两互相重叠的引物进行PCR扩增，经1%核酸凝胶电泳分别得到了大小为1000-1500 bp左右的9条片段（图2和图3）。

4、全基因组序列测定

  将ZJ201501和ZJ201504的9个目的片段分别依次进行切胶、回收和测序，运用Seqman软件对其测序结果分别进行拼接得到其完整的序列；ZJ201501和ZJ201504的全长分别是10 991 bp和10 992 bp，均只有1个ORF，长度为10 278 bp，编码3625个氨基酸。目前，这两株病毒的序列已经提交至GenBank，其登录号分别是KY623435和KY623432。

5、序列分析及系统进化树及结果

  利用MegAlign软件进行序列比对，发现ZJ201501 和ZJ201504在ORF核苷酸水平上具有高达99.9%的同源性，仅有2个氨基酸位点的差异，分别位于E蛋白281位点和NS5蛋白839位点上。运用Mega7.0软件，以GenBank中选取的19条序列为参考序列，选取邻近法基于ORF核苷酸水平和E蛋白氨基酸水平进行系统发育树的构建（图4），ZJ201501 和ZJ201504位于同一个分支上，与其他DTMUV在ORF核酸和E蛋白上的同源性分别高于97.1%和98.4%，与2013年分离的GX2013G和CQW1的遗传距离较近，但与2010年分离的DTMUV-FX2010遗传距离较大。无论是从基于ORF核苷酸还是E蛋白构建的系统发育树来看，ZJ201501 和ZJ201504均与DTMUV-FX2010有较大的差异，进一步分析序列发现，共有16个氨基酸位点的差异，其在C、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4B和NS5蛋白上分别有1、4、3、4、1、1、1和1个氨基酸位点差异（表3）。这表明，DTMUV随着年份的变化，其氨基酸发生了一定的变化，但该变化是否引起DTMUV的抗原性或对鸭子的致病力的改变还需进一步通过动物回归实验进行验证。

结 论

  本研究利用病毒分离、RT-PCR技术对2015年浙江某2个鸭养殖场的6份病料成功分离鉴定到两株DTMUV ，分别命名为ZJ201501和ZJ201504。利用9对两两相互重叠的PCR引物，对这两株病毒的全基因进行分段PCR扩增，经序列测定和拼接，得到病毒的全基因组序列。核苷酸序列和E蛋白氨基酸序列比对分析发现，,ZJ201501和ZJ201504的核苷酸同源性高达99.9%，全长氨基酸仅有2个位点差异。与GenBank中选取的19株DTMUV参考序列相比，在核苷酸水平和E蛋白氨基酸水平上，它们的同源性分别大于97.1%和98.4%，而ZJ201501和ZJ201504与早期分离的DTMUVFX2010遗传距离最远，这表明DTMUV在鸭群中发生了一定的变异。本研究为进一步了解DTMUV的遗传进化提供了理论依据。

  针对此种情况，驰骋祥水禽疫病研究所魏老师特制订出针对性方案“（鸭坦布苏综合防治“四个一”方案=1+1+1+1）”，具体方案见下：
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  B、新常态下鸭鹅病的流行情况：水禽黄病毒、鸭坦布苏病毒、传染性浆膜炎病的高发期，为了避免或减少养殖肉鸭肉鹅的朋友，经济少受损失，水禽疫病防控专家魏老师建议：在肉鸭、肉鹅 7-9日龄、18-20日龄、28-30日龄，这三个重要的时间段，准时投喂“驰骋芪贞颗粒+好得快或替嘉康+驰骋EAD乳液”即可达到防控黄病毒、坦布苏病毒的发生和流行。
    经以上方案治疗，临床反应效果较佳。 

文章来源

 王宾宾,闫大为,倪欣涛,李雪松,滕巧泱,杨健美,陈鸿军,刘芹防,李泽君.鸭坦布苏病毒分离鉴定及全基因组序列分析.中国动物传染病学报,2017,25(6):8-14.

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