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临床上H9亚型禽流感的分离一般采用PCR方法鉴定之后再接胚分离。检测病料是否阳性以普通PCR为主，而荧光定量PCR方法相对普通PCR方便快捷，假阳性率低等优点在一些养殖单位也有应用。在日常病毒阳性鉴定实践中，往往荧光定量PCR鉴定阳性率高，普通PCR次之，而病毒分离阳性率最低，也就是说鉴定阳性的病料未必能分到病毒。
鉴定阳性的病料未必能分到病毒，主要的原因有以下几种：
首先，鉴定阳性样品里的病毒已失活。分离到病毒的最重要前提就是分离样品中必须含有活毒，而不管是荧光定量PCR和普通PCR方法只能检测核酸，而不能判定该病毒核酸是否是活毒，如果病料在保存、运输和处理不当的时候，以及保存时间过长或反复冻融次数过多时，导致病毒已失活，因此PCR检测阳性却分离不出病毒。其次，病毒缺乏足够的感染力。我们主要以鸡胚尿囊液接种的方法分离病毒，但同种病毒，不同毒株对鸡胚的感染力和培养滴度是不一样的，对于低感染力的毒株需要更高浓度才能使毒株得到扩繁。比如疫苗毒株的接种和扩繁需要合适的稀释才能保证其抗原的扩繁，浓度过低的毒种稀释液就算有活毒也未必能繁殖抗原。第三，PCR方法均存在假阳性的机率。假阳性一直是PCR方法的主要缺陷之一。除了探针、引物设计的特异性不够高之外，还有环境、设备仪器、以及相关试剂溶液、样品的污染。比如在样品的处理的过程中，PCR体系的配置，PCR扩增等环节存在气溶胶污染的情况，以及在样品处理和PCR过程中存在交叉污染，特别是长期检测同类病原的地方，加上PCR方法的高度敏感性，假阳性的概率会提高。因此，病毒检测阳性未必来源于病料。第四，不同PCR方法灵敏度不一样。在引物设计中，荧光定量PCR扩增的目标基因片段往往比普通PCR短，这样的话可以提高扩增效率，缩短检测时间。而待测样品中病毒失活后保留的基因片段刚好能够荧光定量PCR扩增，但却没有普通PCR可以扩增的较长的基因片段，所以这有可能是荧光定量PCR阳性率更高的原因之一。最后，不同分离方法其分离敏感度不一样。国内多个学者研究表明不同分离方法会影响流感的分离率。余衍亮等在《3种分离流感病毒方法的比较分析》研究中发现，采用MDCK细胞接种法与鸡胚羊膜腔接种培养法同样敏感，这两种方法均比鸡胚尿囊腔接种培养法敏感。杨式芹等在《流感病毒不同分离方法的比较》中研究结果显示，433份标本中用MDCK细胞分离可以甲型流感25株，而鸡胚尿囊腔接种培养法只能分离到9株。陈明春等在《不同方法分离流感病毒结果分析》表明，利用常规双腔法仅能从467份标本中分离到1株流感病毒，而细胞培养法可以从同样的样品中分离到10株。另外，接种鸡胚为阴性而细胞培养HA阳性的细胞培养液转接种鸡胚，其HA滴度必须达到1:32才能在鸡胚中传出阳性，而采用鸡胚培养法分离出阳性毒株的原始标本同时接种MDCK细胞，90%第1代出现HA滴度大于等于1:32的阳性株。从以上可以看出，细胞培养比鸡胚培养法敏感。为了提高病料、采集拭子等的病毒分离率，建议做好以下几点：1、H9亚型禽流感主要通过呼吸道侵袭家禽，采集的病料最好包括气管，肺脏等，采集拭子时应在咽喉部采集。2、标本采集应立即放入保冷箱中，如保存时间较长，需要在-20℃以下保存。运输过程中尽量保证低温，减少活病毒的损失。3、病料建议反复冻融3次，以增加细胞中病毒的释放量。棉拭子加入缓冲液或生理盐水后应振荡处理，以提高棉拭子病毒的分离量。4、参照中国科学院武汉病毒研究所专利中（一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚尿囊腔接种方法CN200610134414.9）介绍的方法，使用双腔法增加病毒接种量来提高分离率。5、使用鸡胚羊膜腔接种培养法或MDCK细胞培养法替代鸡胚尿囊腔接种培养法来提高病毒分离率，或者同时使用以上方法来提高分离率。其中MDCK细胞应在复壮后细胞状态良好的时候接种分离病毒。6、对于可疑样本，应盲传几代，以保证阳性病毒不遗漏。一般情况下，盲传3代后仍为阴性的话，可以判定为阴性。以上方法可以结合实际情况开展。（来源：张文炎 大华农）
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