鸡鸭鹅病防治网联合驰骋中兽医研究所共同分享：

鸭疫里默氏杆菌对蛋鸡输卵管堵塞影响的研究

摘要

  为探究某蛋鸡群输卵管栓塞的病原学因素，本试验从一例发生输卵管栓塞的蛋鸡中分离到一株细菌并进行鉴定，确认其为血清1型鸭疫里默氏杆菌（Riemerella Anatipestifer, RA）。随后，将该菌株对大日龄蛋鸡进行人工攻毒试验以评估其致病性。动物试验分5组，分别为未免疫+RA攻毒组、未免疫+QX疫苗株/RA攻毒组、RA疫苗免疫+RA攻毒组、未免疫+MS疫苗株/RA攻毒组、未免疫+生理盐水对照组。各组鸡在88日龄和101日龄进行2次攻毒，并在首次攻毒后10天、20天和26天随机剖杀解剖试验鸡。动物试验结果表明，RA攻毒组、QX疫苗株/RA攻毒组、MS疫苗株/RA攻毒组的鸡均出现输卵管栓塞症状，而RA灭活疫苗免疫能够对攻毒鸡起到一定保护作用。

  该研究结果证明RA是蛋鸡输卵管栓塞问题的重要发病因素，试验结果为蛋鸡输卵管栓塞的防治提供了理论依据。

  关键词：蛋鸡；输卵管堵塞；鸭疫里默氏杆菌；分离鉴定；致病性研究 

  本研究对输卵管堵塞病鸡进行实验室病原学检测，结果在病鸡输卵管中分离出一株细菌，经革兰氏染色、PCR鉴定及血清分型最终鉴定为血清1型鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）。本试验进一步使用蛋鸡对该菌株进行人工攻毒试验，对其致病性进行了系统探究。

01 材料与方法

1、病料来源

天津某规模化蛋鸡场93日龄蛋鸡出现输卵管栓塞症状（图1），采集具有明显病变的输卵管进行病原的检测和分离鉴定。

图1 蛋鸡输卵管干酪物堵塞临床解剖症状

2、 实验动物及毒株

68日龄健康海兰褐蛋鸡购自天津某蛋鸡场，经抗原抗体检测，所用试验鸡未感染禽流感、新城疫、传染性支气管炎、滑液囊支原体等疫病。鸡滑液囊支原体MS活疫苗（109 CCU/mL）、鸡传染性支气管炎QX株活疫苗（2×106 EID50/mL）由天津瑞普生物技术股份有限公司提供。RA灭活疫苗由天津瑞普生物技术股份有限公司制备。

3、 细菌分离培养

根据参考文献，无菌蘸取输卵管干酪物，在含有5%牛血清的TSA琼脂培养基上划线，倒置平板分别于37℃微需氧环境下培养24～48h。观察细菌生长情况及其菌落形态特征。选取可疑菌落，用含有5%牛血清的TSA琼脂培养基进行纯化，挑取形态特征一致的单个疑似菌落进行革兰氏染色，镜检观察染色特性和形态。

4、动物回归试验

挑选55只饲养至68日龄的健康蛋鸡，随机分5个组，每组各11只，其中每组内10只为试验个体，1只为同居组对照。具体操作如表2所示。其中，E11组仅接种RA，E12组同时接种QX疫苗株和RA，E14组同时接种MS疫苗株和RA，E13组在68日龄先免疫RA灭活疫苗，再接种RA；E15为对照组，接种生理盐水。各组鸡均攻毒两次（88日龄、101日龄）。首次攻毒后10天，每组剖检2只；二次攻毒后7天，每组剖检4只；二次攻毒后13天，每组剖检4只，观察组织器官的病理变化，同时记录动物的临床症状及死亡情况。

02 结  果

1、细菌的分离与鉴定

从输卵管干酪物分离到纯净的半透明、边缘整齐、露滴状、乳白色的菌落（图2A）。经革兰氏染色镜检后发现为革兰氏阴性短杆菌，多呈单个状态，部分丝状菌（图2B），菌落形态及革兰氏染色镜检符合RA形态。

图2 鸡源鸭疫里默氏杆菌的分离与革兰氏染色

A. TSA琼脂培养基所分离的菌落形态

B. 分离菌株的革兰氏染色（1000×）

2、PCR鉴定与序列分析

以分离菌的基因组为模板，使用设计的OmpA基因特异性引物进行PCR扩增，获得约为 654 bp的目的条带（图3），与预期大小相符。

图3 OmpA基因的PCR扩增结果

M：DL-2000 DNA相对分子质量标准

1：OmpA基因片段 2：阳性对照；3：阴性对照；

3、分离菌株的血清学鉴定

玻片凝集试验结果显示，该分离株RA只与1型鸭疫里默氏杆菌阳性血清反应后出现白色沉淀现象，与2型、4型、5型、6型、7型、10型、11型、12型、18型RA阳性血清均未发生特异性反应，由此确定该分离株为血清1型RA。

4、人工攻毒试验结果

首次攻毒后10天，E11、E12分别有一只出现输卵管堵塞；二次攻毒后7天（首次攻毒后20天），单独接种RA的E11组有一只出现输卵管堵塞；二次攻毒后13天（首次攻毒后26天），E11同居组1只出现输卵管堵塞（图4，图5）。此外，单独接种RA的E11组有一只出现呼吸道症状，而QX疫苗株+RA组则有60%（6/10）出现呼吸道症状，MS疫苗株+RA有50%出现呼吸道症状（5/10）。回归试验结果汇总见表3。

图4 攻毒后试验鸡输卵管病变

A-C：E11组编号2044、2126、2088试验鸡

D：E12组编号2048试验鸡。

03、讨 论

上述结果表明，RA是造成临床蛋鸡输卵管堵塞的重要因素。为更全面模拟生产中的实际情况，本研究在进行RA攻毒的同时，设立了IBV QX疫苗株+RA，以及MS野毒株+RA两个试验组。有观点认为，IBV QX疫苗株和MS疫苗株有可能在输卵管堵塞中发挥一定作用。试验结果与我们预期不完全一致，IBV QX疫苗株和MS疫苗株并未增加试验鸡输卵管栓塞发生的比例，但是这两个试验组鸡只出现呼吸道症状的比例较高。

事实上，IBV QX疫苗株和MS疫苗株不易引起大日龄鸡的呼吸道症状。但当RA与IBV QX疫苗株和MS疫苗株联合攻毒后，试验鸡发生了较高比例的呼吸道症状，提示混合感染可能增强了QX疫苗株和MS疫苗株的致病能力。当然也有可能联合攻毒增强了RA对呼吸道的损伤作用，这需要未来更系统的动物试验进行验证。此外，本研究还探究了RA灭活疫苗的保护作用。初步研究表明，RA灭活疫苗有助于预防RA诱发的输卵管堵塞现象，这为未来该病的防控提供了思路和技术支持。

在后续的致病性研究及鸡场防控方案中，首先从发病鸡群分离鉴定鸭疫菌株及其血清型，给客户一对一订制产品雅易安（鸭疫二价灭活苗），对30日龄左右青年蛋鸡和种鸡群进行免疫（颈部皮下0.4ml/羽份）；然后使用瑞普生物泛易平（转移因子）+ 好得快（复合乳化中药植物精油）进行治疗，同时在新流等灭活油苗中添加倍扶欣（头孢噻呋注射液），以上疫苗及药物方案能够100%防控鸡群的鸭疫里默氏杆菌和输卵管堵塞问题。

ü 关爱生命，关注健康，我们在行动！！！为养殖业保驾护航，做养殖户的忠实朋友。

ü 当今驰骋保健研究所认为: 体液酸碱平衡, 补中益气、扶正祛邪、修复黏膜、动物机体不发病! 绿色自然健康养殖技术指导：139-3902-7068（魏老师） 蛋鸭精准管理专家-成龙在路上13838248089

ü 无抗解决蛋鸡、种鸡卵黄性腹膜炎、大肠杆菌--驰骋好得快口服液

ü 【功能与主治】本品具有清热解毒、涩肠止泻、活血凉血、抗菌消炎之功效。主治；

ü 1、大肠杆菌引起的蛋鸡、蛋鸭败血症、心包炎、肝周炎、全眼球炎、气囊炎及其它血清型大肠杆菌引起的卵黄性腹膜炎、输卵管炎、种禽的蛋子瘟、关节炎及滑膜炎、肿头综合症、肠炎等。

ü 2、种鸡、种鸭、蛋鸡葡萄球菌病和链球菌病、对雏鸡副伤寒、禽霍乱、溃疡性肠炎、梭菌性肠炎、鼻窦炎、流行性感冒、传染性肝炎等引起精神沉郁、嗜眠、缩颈、腿软弱、两翅下垂、食欲不振或不食；明显表现咳嗽、打喷嚏，眼有浆液性或粘液性分泌物，常使眼周围羽毛粘连，形成“黑眼圈”；鼻孔流出浆液或粘液，分泌物干后常堵塞鼻孔，表现出呼吸困难；排出绿色、黄绿色或黄白色稀粪，气味很臭等症。

ü 【用法用量】饮水，每100ml兑水300-400升；预防用2000只鸡鸭；治疗用1000只鸡鸭，连用3-4天。