用鸭胚筛选抗鸭黄病毒药物实验 （陆新浩 宁波禽病研究高级兽医师）
1、目的：为了筛选出有效的抗鸭黄病毒的药物，试验用目前市场上常见的8种抗病毒药物（利巴韦林、阿昔洛韦、金刚乙胺、奥司他韦、脱氧若卡素钠、盐酸阿比多尔、吗啉胍、金刚烷胺）以及纯中药清瘟解毒口服液与鸭黄病毒C01株同时接种鸭胚，通过观察抗病毒药物能否保护鸭胚不被病毒致死来判断抗病毒药对鸭黄病毒是否有效。鸭黄病毒发病后：确实有效的防控方案（鸭黄病毒综合防治“傻子”方案=1+1+1+1）：“都好TM（特制板青颗粒A）” ＋“好得快”＋“新力欣或新泰瑞”+“优免或芪力多或阿司匹林粉”，将全天用量集中1次在三个小时饮完，连用4-5天。对于个别严重的卧在地上不愿走动，基本不能喝水吃料的，用清灵或优免+新六甲或新力培联合皮下注射。
2、材料与方法
2.1 材料
鸭黄病毒C01株由余姚市禽病防治研究所分离病保存；抗病毒药物金刚乙胺、奥司他韦、脱氧若卡素钠、盐酸阿比多尔、吗啉胍、金刚烷胺、利巴韦林注射液购自江苏四环生物股份有限公司，阿昔洛韦片购自浙江亚太药业股份有限公司，清瘟解毒口服液采购自义乌双峰动物药业有限公司；0.22um一次性无菌滤器购自MILLIPORE公司；1ml、2.5ml、5ml一次性无菌注射器购自浙江康康医疗器械有限公司；10日龄麻鸭胚购自余姚市某孵化场；9日SPF鸡胚购自余姚市某SPF鸡场。
2.2 鸭黄病毒C01株ELD50的测定
将鸭黄病毒C01株第8代鸭胚尿囊液10倍梯度稀释至10-6，取10-1-10-66个滴度分别接种9日龄SPF鸡胚和10日龄麻鸭胚，每个滴度分别接5枚胚，每枚胚接0.2ml。连续观察6天，除去24小时内死亡，记录6天内胚的死亡情况，根据 Reed-Muench 方法计算病毒的ELD50。
2.3 抗病毒药物对胚的毒性试验
将抗病毒药物利巴韦林、阿昔洛韦、金刚乙胺、奥司他韦、脱氧若卡素钠、盐酸阿比多尔、清瘟解毒口服液、吗啉胍、金刚烷胺用0.22um的无菌一次性滤器过滤除菌后，分别稀释成150mg/ml，100mg/ml，50mg/ml，25mg/ml共4个稀释度，每个稀释度接麻鸭胚5枚，每枚胚接0.2ml，于370C培养观察10天。除去24小时内死胚，记录胚的死亡情况。
2.4 抗病毒药物的筛选
鸭黄病毒C01株稀释成100ELD50，抗病毒药利巴韦林、阿昔洛韦、奥司他韦、脱氧若卡素钠、清瘟解毒口服液、吗啉胍稀释成50mg/ml，金刚乙胺、盐酸阿比多尔、金刚烷胺稀释成25mg/ml，取0.2ml病毒液和等量的抗病毒药物同时接胚，每种抗病毒药物接5枚胚。同时病毒液和各种抗病毒药物分别单独接3枚胚作为病毒对照和药物对照。置于370C培养观察6天。除去24小时内死胚，记录胚的死亡情况。
3、结果
3.1 鸭黄病毒C01株ELD50的测定结果
用麻鸭胚测C01株ELD50，6天后胚的死亡情况如表1，其ELD50为10-2.6/0.2ml。
表1 用麻鸭胚测ELD50
|
病毒液稀释度 |
活胚数 |
死胚数 |
死亡率 |
|
10-1 |
0 |
5 |
100% |
|
10-2 |
0 |
5 |
100% |
|
10-3 |
4 |
1 |
20% |
|
10-4 |
5 |
0 |
0 |
|
10-5 |
5 |
0 |
0 |
|
10-6 |
5 |
0 |
0 |
用SPF鸡胚测C01株的ELD50，6天后胚的死亡情况如表2，其ELD50为10-2.8/0.2ml。
表2 用SPF鸡胚测ELD50
|
病毒液稀释度 |
活胚数 |
死胚数 |
死亡率 |
|
10-1 |
0 |
5 |
100% |
|
10-2 |
0 |
5 |
100% |
|
10-3 |
3 |
2 |
40% |
|
10-4 |
5 |
0 |
0 |
|
10-5 |
5 |
0 |
0 |
|
10-6 |
5 |
0 |
0 |
3.2 抗病毒药物对胚的毒性试验结果
用不同稀释度的抗病毒药物接胚后，10天内胚的死亡清况如表3，从表中可以看出金刚乙胺和金刚烷胺对胚的毒性较大，50mg/ml时还能引起胚胎死亡而25mg/ml时不会致死胚，所以我们做下一步试验时用25mg/ml的浓度进行试验，而其他抗病毒药物在浓度为100mg/ml时，只引起少量胚胎死亡，当浓度为50mg/ml时不会致死胚胎，50mg/ml的浓度可以用于下一步试验。
表3 不同浓度的药物引起鸭胚的死亡数
|
|
150mg/ml |
100mg/ml |
50mg/ml |
25mg/ml |
|
利巴韦林 |
5 |
1 |
0 |
0 |
|
阿昔洛韦 |
4 |
2 |
0 |
0 |
|
金刚乙胺 |
5 |
5 |
3 |
0 |
|
奥司他韦 |
4 |
1 |
0 |
0 |
|
脱氧若卡素钠 |
5 |
2 |
0 |
0 |
|
清瘟解毒口服液 |
3 |
0 |
0 |
0 |
|
吗啉胍 |
5 |
2 |
0 |
0 |
|
金刚烷胺 |
5 |
3 |
1 |
0 |
|
盐酸阿比多尔 |
5 |
2 |
0 |
0 |
3.3 抗病毒药物的筛选结果
用0.2ml 100ELD50的鸭黄病毒C01株与等量的抗病毒药物同时接5枚胚，6天后除清瘟解毒口服液有3枚胚存活外所有胚均死亡，只注射药物的胚均未死亡，只注射病毒的胚全部死亡（见表4）。结果表明除清瘟解毒口服液对胚具有60%的保护作用，其它抗病毒药物在胚中对病毒没有作用。
表4 抗病毒药的筛选结果
|
|
与病毒液同时接胚（5） |
药物对照（3） |
病毒对照（3） |
|||
|
活胚数 |
死胚数 |
活胚数 |
死胚数 |
活胚数 |
死胚数 |
|
|
利巴韦林 |
0 |
5 |
3 |
0 |
0 |
3 |
|
阿昔洛韦 |
0 |
5 |
3 |
0 |
0 |
3 |
|
金刚乙胺 |
0 |
5 |
3 |
0 |
0 |
3 |
|
奥司他韦 |
0 |
5 |
3 |
0 |
0 |
3 |
|
金刚烷胺 |
0 |
5 |
3 |
0 |
0 |
3 |
|
利巴韦林 |
0 |
5 |
3 |
0 |
0 |
3 |
|
吗啉胍 |
0 |
5 |
3 |
0 |
0 |
3 |
|
盐酸阿比多尔 |
0 |
5 |
3 |
0 |
0 |
3 |
|
清瘟解毒口服液 |
3 |
2 |
3 |
0 |
0 |
3 |
|
脱氧若卡素钠 |
0 |
5 |
3 |
0 |
0 |
3 |
总结，鸭黄病毒对麻鸭胚和SPF鸡胚的ELD50分别为10-2.6/0.2ml，10-2.8/0.2ml；金刚乙胺和金刚烷胺的浓度为25mg/ml 0.2ml每枚胚时对胚鸭没有致死性，而利巴韦林、阿昔洛韦、奥司他韦、脱氧若卡素钠、盐酸阿比多尔、清瘟解毒口服液、吗啉胍的浓度为50mg/ml 0.2ml每枚胚时对鸭胚没有致死性；病毒与抗病毒药物同时接种鸭胚后，病毒同样能致死鸭胚，清瘟解毒口服液对鸭胚具有60%的保护效果。
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