复方戊二醛消毒剂对鸡禽流感病毒（H9N2株）杀灭效果的研究   驰骋种禽用药防控与营养保健研究所

[摘要]研究了一种复方戊二醛消毒剂对鸡禽流感病毒(AIVH9N2株)的杀灭效果及稳定性。将该消毒剂1：500稀释度的溶液在20cc条件下与等量2×10EID。AIV(H9N2株)病毒液作用，10min内可完全杀灭AIV(H9N2株)病毒；该消毒剂1：500稀释度的溶液在室温下放置2d，仍能保持原有的消毒效果。

[关键词]复方戊二醛消毒剂；禽流感(H9N2株)病毒；消毒效力；稳定性

在畜牧业生产中，选择高效低毒消毒剂具有实际而深远的意义。在控制饲养环境和预防动物疫病中，消毒是预防和扑灭传染病最有效的措施；而选择理想的消毒剂，是做好传染病防治工作的关键。目前市场上消毒剂种类繁多，而高效低毒的却较少。近年来的研究表明：依据增效原理将戊二醛与阳离子表面活性剂(双链季铵盐)复配制成复方戊二醛消毒剂，是一种高效低毒广谱的复合型消毒剂。戊二醛对所有的病原微生物均有效，它能破坏细菌表面的蛋白受体；季铵盐对大多数细菌具有较好的杀灭作用，而对芽孢、真菌及无囊膜病毒没有作用，且易产生抗药性，季铵盐同细菌细胞壁膜上的多磷脂反应，能使细菌细胞壁上的肽变性。季铵盐阳性表面活性剂对戊二醛有明显地协同增效作用，二者配合使用，既扩大了抗菌谱，充分发挥各自的消毒特点，又具有协同作用，而且可以减少阳离子表面活性剂中醛的气味，降低醛的腐蚀性。因此二者复方能以较低浓度达到更高效的消毒作用，且减小毒副作用，使用方便，这是单一消毒剂所难以达到的。为了克服戊二醛或季铵盐单方消毒剂所存在的缺陷，笔者研究了双链季铵盐对戊二醛消毒剂的增效或协同作用。本研究结果为在防治禽流感病毒(H9N2型)中正确使用双链季铵盐与戊二醛复方消毒剂并制定合理的消毒措施提供了依据和参考。

1材料

1．1  受试病毒禽流感病毒H9亚型，分离自山东一些产蛋下降鸡群，并经过鉴定。

1．2  化学药品及试剂复方戊二醛消毒剂：5％双链季铵盐+5％戊二醛，规格500mL／瓶，由齐鲁动物保健品有限公司提供；中和剂(1％甘氨酸和3％吐温一80)：取10g甘氨酸，30g吐温一80，加入蒸馏水至1000mL，灭菌备用；0．03mol／L灭菌磷酸盐缓冲液(PBS，pH7．2)：磷酸氢二钠2．83g，磷酸二氢钾1．36g，蒸馏水1000mL，调pH值为7．2，灭菌备用；灭菌生理盐水，自制。

1．3  10日龄SPF鸡胚山东省农科院SPF鸡场孵化。 

2方法

2．1 禽流感H9亚型病毒的分离与鉴定

2．1．1  禽流感H9亚型病毒的分离2012年冬，从山东一些产蛋下降鸡群中采集病死鸡肝、脾、脑、气管等组织；活禽用棉拭子涂擦喉头或泻殖腔。将病料或带分泌物的棉拭子按1：10的比例放人汉克氏液(每1mL中含青、链霉素各2000单位，pH值7．2—7．6)中，4℃作用4h，将其制成10％乳剂；将带病料的棉拭子充分捻动、拧干后除去。样品经3000r／min离心30min，取上清液用0．22m的无菌滤膜过滤除菌。取滤液，尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚10枚，0．2mL／枚，置于37℃孵育，每日上、下午各照胚1次，弃去24h前死亡鸡胚，收集24～96h死亡鸡胚和96h存活鸡胚，于4℃放置12h，在无菌条件下吸取尿囊液进行病毒血凝价测定。凡死亡胚尿囊液对鸡红血球有血凝反应者，均用已知抗新城疫病毒血清及抗EDS76病毒血清对其做血凝抑制反应。如不产生血凝抑制反应，则怀疑为流感病毒，然后做纯化处理。

2．1．2  病毒的鉴定将分离的病毒经SPF鸡胚连传5代后，送中国预防医学科学院流感中心鉴定。经鉴定属H9N2亚型禽流感病毒。

2．2  病毒的制备 将毒种用灭菌生理盐水稀释至10-3，经尿囊腔接种5枚10日龄SPF鸡胚，剂量0．1mL／枚，连传2代，置于37℃孵育，每日上、下午各照胚1次，弃去24h前死亡鸡胚，收集24～96h死亡鸡胚和96h存活鸡胚液装于灭菌容器内。将检验无菌、且对红细胞凝集价HA≥1：256的鸡胚液混合，定量分装于安瓿中，置一70℃备用。试验前测定鸡胚半数感染量(EID50)。

2．3 消毒剂对鸡胚最大安全剂量测定?用生理盐水将消毒剂稀释成不同浓度的溶液(见表1)，每个稀释度注射5枚10日龄鸡胚，尿囊腔内注射，剂量0．2mE／枚，置37℃孵育，连续观察120h，同时设生理盐水对照组。重复试验3次。

2．4 病毒血凝价的测定依照文献采用96孔微量板法进行测定，含AIVH9N2的鸡胚液对鸡红细胞凝集价为2。

2．5 病毒鸡胚半数感染量的测定将2．2项制备的胚液用灭菌PBS做10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-9 3个稀释度，各经尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚5枚，每胚0．1mL，置37℃孵育，连续观察120h，分别测定各稀释度接种鸡胚的红细胞凝集价，凝集价HA≥1：64者判为感染，计算EID50，同时设生理盐水对照组。试验重复进行3次。结果每0．1mL≥10EID50。

2．6 消毒剂对AIV(H9N2株)的杀灭效果试验将复方戊二醛消毒剂分别稀释200、500和1000倍，然后将含AIVH9N2的胚液稀释为含病毒2X105EID50／0．1mL，将不同浓度的复方戊二醛消毒剂2．5mL分别与稀释后的病毒胚液等量混合，分别于20℃作用5、10、30min。从上述溶液中各取1mL加入到9mL中和剂中，用中和后的溶液经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，每浓度消毒剂接种5枚鸡胚，每胚0．2?mL。孵化培养96h，弃去24h前死亡鸡胚，将24—96h死亡的鸡胚及最终存活胚取出，置0～4℃冷藏4h以上，对冷藏后的鸡胚逐个取胚液作病毒血凝价测定。如果HA为阴性表示病毒被灭活，HA为阳性表示病毒未被灭活。同时设消毒剂、生理盐水、病毒与空白对照组。以鸡胚尿囊液中AIV(H9N2株)的HA试验阴性的消毒剂最低浓度作为最低杀灭病毒浓度。

2．7  复方戊二醛消毒剂连续使用的稳定性按使用浓度(1：500)配好消毒液，将此消毒液常温下放置2d，分别取样，按农业部颁布的《兽用消毒剂鉴定技术规范》的有关要求，于室温下与AIV(H9N2株)作用10min，测病毒血凝价HA，观察该复方消毒剂正常使用时(1：500稀释)的稳定性。

3  结果

3．1  复方戊二醛消毒剂对鸡胚的最大安全剂量

复方戊二醛消毒剂浓度低于0．5％时，按0．2mL剂量经尿囊腔注射于10日龄SPF鸡胚中，鸡胚发育正常，无死亡发生。

3．2  消毒剂杀灭AIV(H9N2株)的效果

将消毒剂按l：500稀释，于20℃与AIV(H9N2株)作用10min，可有效杀灭AIV(H9N2株)。

3．3 消毒剂连续使用的稳定性按消毒剂鉴定规范要求，测定放置2d的1：500稀释的消毒液，病毒液与其作用后的血凝价均为2。

4  讨论与小结

4．1 任何高浓度的消毒剂对鸡胚均有致死性。本次试验测定了复方戊二醛消毒剂对鸡胚的最大安全剂量。结果表明，当消毒剂浓度低于0．5％时，10日龄SPF鸡胚尿囊腔注射0．2mL，鸡胚不发生死亡，且发育正常。高于0．6％时可致死鸡胚，说明高浓度消毒剂对鸡胚有毒性作用，因此在实际应用中一定要注意消毒剂的使用浓度，不宜过大，以免造成对动物的伤害。

4．2 消毒效果取决于消毒剂的有效浓度及其作用时间。由试验结果可见，复方戊二醛消毒剂使用浓度越高，对AIV(H9N2株)的杀灭效果越好；作用时间越长，对其的杀灭效果越强。

4．3 复方戊二醛按使用浓度(1：500)配制，常温下放置2d仍能保持原有的消毒效力，表明按使用浓度(1：500)稀释后，在两天内其作用是稳定的。

4．4 根据以上试验，复方戊二醛消毒剂可用于杀灭AIV(H9N2株)，且按使用浓度(1：500)在稀释后2d内使用。

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